朊病毒疾病（Prion Disease）是一种罕见但致命的神经退行性疾病，其特征是由于朊病毒蛋白（Prion Protein, PrP）的异常折叠，导致神经细胞损伤和脑功能的逐步衰退。尽管这种疾病包括多种亚型，例如克雅氏病（Creutzfeldt–Jakob Disease, CJD）、格斯特曼-施特劳斯勒-申克病（Gerstmann–Sträussler–Scheinker Syndrome, GSS）和致死性家族性失眠症（Fatal Familial Insomnia, FFI），它们均具有极高的致死率，目前尚无有效治疗手段。这一令人痛心的现实使得研究人员不断探索如何阻止或延缓疾病的进展。
近年来，随着基因编辑技术的飞速发展，研究人员开始探索通过改变基因组来阻止朊病毒蛋白的异常累积。基因敲除的研究表明，缺乏朊病毒蛋白的小鼠对朊病毒感染具有完全的抗性，而人携带某些天然缺失突变（例如PRNP R37X变异）也未表现出任何病理特征，这为通过基因干预治疗朊病毒疾病提供了理论依据。
1月14日Nature Medicine的研究报道“In vivo base editing extends lifespan of a humanized mouse model of prion disease”，正是基于这一科学发现，设计了一种体内碱基编辑（Base Editing）技术，通过精准地将提前终止密码子引入编码PrP的PRNP基因中，从而实现蛋白质表达的永久性降低。这种策略不仅可以显著减少大脑中的PrP水平，还能延长携带人朊病毒基因的转基因小鼠的寿命。
此外，该研究还解决了许多基因治疗的关键技术难题，例如病毒载体的高效递送、编辑器的特异性优化以及副作用的控制。通过采用双腺相关病毒（Dual-AAV）系统和高度优化的碱基编辑器，研究团队成功地在小鼠模型中实现了高效的基因编辑，同时显著降低了脱靶效应。这一突破性成果不仅为朊病毒疾病提供了潜在的一次性治疗方案，也为其他神经退行性疾病的基因疗法铺平了道路。
这项研究的成功展示了基因编辑技术的巨大潜力，并让我们得以窥见未来精准医学的新方向。在科学和医学不断交汇的今天，这项研究无疑是一座里程碑，不仅为无数患者带来了希望，也向我们揭示了基因组治疗的无限可能性。
朊病毒疾病：一场无声的致命风暴
朊病毒疾病（Prion Disease）是一类极其罕见却致命的神经退行性疾病，其致病机制如同“分子多米诺骨牌”，由一种名为朊病毒蛋白（Prion Protein, PrP）的异常折叠触发。正常情况下，PrP在神经细胞中以特定方式折叠，发挥其生理功能。然而，一旦其结构发生病理性改变，这种异常的“错误模板”会通过接触正常PrP触发连锁反应，使其也变为异常折叠状态，形成难以清除的蛋白聚集物。这些聚集物逐渐积累，破坏神经元，引发神经系统不可逆的功能损伤。
目前，朊病毒疾病被归类为人类最致命的疾病之一，包括散发性克雅氏病（sCJD）、遗传性克雅氏病、格斯特曼-施特劳斯勒-申克病（GSS）以及致死性家族性失眠症（FFI）等多种亚型。这些疾病的共同特征是其发病迅速、病程短暂以及100%的死亡率。以散发性克雅氏病为例，其占朊病毒疾病病例的85%，患者从发病到死亡的平均时间不足一年。
更令人担忧的是，朊病毒疾病目前无药可治。即便针对其病因的研究已经取得了诸多突破，但临床试验中的候选药物尚未成功转化为有效的治疗方案。现阶段，治疗手段主要集中于延缓症状进展，但对于疾病根源的控制几乎束手无策。更复杂的是，这种疾病大多数情况下是由自发性突变或随机蛋白折叠错误引发（占85%），而遗传因素和感染途径仅占15%和不到1%。
科学界对于这一问题的关注正在逐年升温。研究显示，降低PrP的表达水平可以显著增强小鼠模型对朊病毒的抗性，这为从根源上治疗疾病提供了可能性。如何精准地减少PrP表达成为当前研究的焦点，而这也正是基因编辑技术展现突破性潜力的领域。
基因编辑：颠覆传统治疗的希望之光
基因编辑技术是现代生物医学领域的一次革命性突破，它为治疗许多过去无解的疾病带来了新的可能性。从最初的基因敲除到近年来的CRISPR-Cas9系统，这些技术逐渐实现了对基因组的精准操控。基因编辑的潜力在于其不仅能矫正遗传突变，还能通过改变基因表达来阻断疾病的病理进程。这使得它成为治疗罕见遗传性疾病的理想工具，而朊病毒疾病正是其中之一。
近年来，碱基编辑（Base Editing）作为基因编辑技术中的新星，展现出了独特的优势。传统的基因编辑通常需要切割DNA双链，这可能导致不稳定的修复反应，如插入或缺失突变。而碱基编辑通过不切割DNA，仅通过化学修饰实现单个碱基的精准转换，显著减少了脱靶效应和不良副作用。这种“精准而温和”的操作方式，特别适合于神经系统这样的敏感组织。
碱基编辑的工作原理类似于“基因打字修正工具”。以该研究中使用的碱基编辑器为例，研究人员设计了一种特定的碱基编辑器（Cytosine Base Editor, CBE），可以将C•G碱基对转化为T•A碱基对。通过这种转换，研究人员能够在目标基因的特定位置引入提前终止密码子，从而阻断蛋白的表达。在针对朊病毒疾病的研究中，这种策略被用来精准地编辑PRNP基因，永久性地减少朊病毒蛋白（PrP）的产生。
而且，碱基编辑技术不仅在精度上优于其他方法，还能显著减少脱靶效应。该研究的数据表明，经过优化的碱基编辑器在实现高效基因编辑的同时，没有观察到与肿瘤相关的明显脱靶突变。这种高特异性和高安全性的结合，使碱基编辑成为一种理想的基因治疗工具，尤其是在需要对特定基因进行永久性修改的疾病中。
破解朊病毒的密码：从基因入手
朊病毒蛋白（Prion Protein, PrP）的异常折叠是导致朊病毒疾病的根本原因，而这一切的核心则指向编码PrP的PRNP基因。PRNP基因位于人类第20号染色体，其编码的PrP在神经系统中发挥重要功能。然而，当基因突变或蛋白质结构发生病理性改变时，PrP会失控折叠形成毒性聚集物，触发神经细胞损伤。研究发现，彻底移除或显著降低PrP水平可以有效阻断其病理作用，而这一策略也成为治疗朊病毒疾病的重要方向。
在该研究中，研究人员通过碱基编辑技术，为PRNP基因设计了一种精准而高效的“开关”——提前终止密码子。提前终止密码子是一种特殊的遗传指令，能在蛋白翻译过程中强制终止，从而避免功能蛋白的产生。研究团队选用了R37X突变，这是一个已知在人类自然界中出现且无毒副作用的提前终止密码子变异，确保了该策略的安全性。
实验过程中，研究人员采用了高度优化的碱基编辑器（Cytosine Base Editor, CBE），通过精确的C→T碱基转换，将目标位点上的R37（精氨酸）突变为X（终止密码子）。数据显示，在小鼠模型的脑组织中，这种编辑器的编辑效率高达37%，显著减少了PrP的表达水平。而且，这种编辑方法同时避免了引入有害的旁效突变（bystander mutations），充分体现了碱基编辑技术的高特异性。
这一研究策略的成功不仅验证了PRNP基因作为治疗靶点的可行性，也揭示了碱基编辑在朊病毒疾病治疗中的巨大潜力。通过精准切断病理性PrP的“供应链”，研究为患者提供了一种全新的治疗希望。
PRNP基因提前终止密码子策略的开发与初步验证（Credit: Nature Medicine）
图a：PRNP基因结构与碱基编辑策略研究团队设计了一种基于CBE（Cytosine Base Editor）的策略，用于在PRNP基因中引入提前终止密码子以抑制PrP表达。PRNP基因包含N端（1–144位氨基酸，深蓝色）和C端（145–253位氨基酸，浅蓝色），其中信号肽（1–22位，灰色）、八肽重复区（51–90位，虚线框）和GPI信号区域（231–253位，灰色）是关键功能区。通过CBE技术，可将CAG（谷氨酰胺）、CAA（谷氨酰胺）、CGA（精氨酸）或TGG（色氨酸）密码子转换为提前终止密码子。设计的sgRNA在目标区域以半箭头标记，成功引入早终止密码子的突变可阻断PrP的纤维模板化能力。
图b：sgRNA编辑效率与插入/缺失突变的发生率在HEK293T细胞中，研究人员利用BE4max编辑器测试了多个sgRNA的编辑效率和插入/缺失突变（indel）的发生率。数据显示，R37X（将第37位氨基酸转换为提前终止密码子）的编辑效率较高，同时插入/缺失突变发生率较低，表明其为一个理想的编辑目标。
图c：旁效编辑分析使用BE4max编辑器和PRNP R37X sgRNA，研究发现了三个可能的旁效编辑位点（G35G、S36S和Y38Y），但这些突变均为沉默突变（即不改变蛋白质序列），进一步验证了编辑策略的高特异性和安全性。
图d：双腺相关病毒递送系统设计为了解决编辑器体积过大的问题，研究团队设计了一种双AAV递送系统。N端AAV携带Cbh启动子、APOBEC脱氨酶结构域和SpCas9前572个氨基酸序列（与NpuN intein融合），而C端AAV携带SpCas9的其余部分（573–1367位氨基酸）和UGI域。两个AAV均包含U6启动子驱动的PRNP R37X sgRNA表达盒。
图e：动物实验设计在携带人类PRNP基因的Tg25109小鼠中，通过Retro-orbital注射递送1×10¹⁴ vg/kg剂量的双AAV系统，并在注射后100天收集脑组织，使用高通量测序（HTS）评估编辑效率，酶联免疫吸附法（ELISA）测定PrP蛋白水平。
图f：R37X编辑效率对照组小鼠未检测到R37X编辑，而接受双AAV PHP.eB BE3.9max治疗的小鼠中，目标位点的R37X编辑效率达到37%。
图g：PrP水平下降与对照组相比，治疗组小鼠脑组织中的PrP水平平均下降了50%，进一步证明了碱基编辑技术在减少PrP表达中的高效性。
突破性实验设计：如何让基因编辑“深入大脑”
基因编辑技术在理论上具备治疗朊病毒疾病的潜力，但如何将编辑工具精确、有效地递送至大脑，是实现这一目标的关键挑战。研究团队创新性地采用了双腺相关病毒（Dual-AAV）递送系统，这种载体凭借其独特的递送能力，为基因编辑深入中枢神经系统开辟了新路径。
腺相关病毒（AAV）以其低免疫原性和高组织穿透性成为基因治疗的明星工具，但单一AAV的容量限制无法承载完整的碱基编辑器。为此，研究团队采用了“分而治之”的策略，将碱基编辑器分为两部分，通过两个独立的AAV载体分别递送至靶点。一旦进入细胞，编辑器的两部分在Npu intein（自组装蛋白）的作用下精准拼接，恢复其完整功能。这种双载体设计不仅解决了容量限制问题，还显著提高了编辑效率。
在小鼠实验中，研究人员通过Retro-orbital注射方式（经眼眶后静脉注射），将载体递送至携带人类PRNP基因的转基因小鼠体内。这种注射方式不仅操作便捷，还能通过PHP.eB外壳的辅助，实现病毒穿越血脑屏障，将编辑器精准送入大脑的神经细胞中。
在注射后100天，小鼠脑组织中的编辑效率高达37%，PrP表达水平降低了约50%。这些数据不仅证明了双AAV递送系统的高效性，还为进一步开发大脑基因治疗技术提供了宝贵经验。
数据说话：结果到底有多惊艳？
首先，研究人员对携带人类PRNP基因的小鼠进行了基因编辑，选择PRNP R37X突变作为提前终止密码子的靶点。实验显示，在双腺相关病毒（Dual-AAV）系统递送碱基编辑器后，小鼠大脑的编辑效率达到37%，PrP水平平均下降了50%。更为重要的是，进一步优化的碱基编辑系统和病毒载体实现了在更低剂量（仅为原始方案的1/6.7）的情况下，使PrP下降比例提升至63%，且未检测到具有临床意义的脱靶效应。这种高效性和安全性的结合，为进一步的临床转化奠定了基础。
这些分子水平的变化也直接体现在了小鼠的寿命上。在接受碱基编辑治疗的小鼠中，其平均寿命延长了52%。对于接种散发性克雅氏病（sCJD）病原的小鼠，其寿命从平均313天延长至499天，增长了59%；而接种E200K突变（遗传性朊病毒疾病最常见突变）的个体，寿命从315天增加至455天，增长了44%。实验还显示，治疗组小鼠在实验期间保持了较好的体重和巢筑行为，这表明治疗不仅延长了生命，也提高了生活质量。
这些数据不仅验证了基因编辑技术对朊病毒疾病的治疗潜力，也暗示了一次性治疗方法可能终结这一致命疾病的希望。更重要的是，这种策略对不同亚型的朊病毒疾病均有效，不受患者特定基因突变的限制。
优化与挑战：让治疗更高效、更安全
基因编辑技术的成功不仅在于其精准的编辑能力，更依赖于编辑器的优化设计与递送载体的改良，以实现更高效、更安全的治疗效果。在该研究中，研究团队针对碱基编辑器和病毒载体进行了全面优化，为治疗朊病毒疾病提供了重要的技术保障。
首先，在编辑器的优化方面，团队采用了一种改良的CBE（Cytosine Base Editor）系统，即TadCBEd。与之前的编辑器相比，TadCBEd不仅具有更高的编辑效率（在体外实验中可达76%），还通过改进sgRNA的结构来进一步提高编辑精确性。研究中使用了一种“U-to-A翻转和5bp扩展”的sgRNA新设计（F+E-sgRNA），显著提高了编辑效率并减少了旁效突变的可能性。
在病毒载体的改良上，团队选择了双腺相关病毒（Dual-AAV）系统，这种系统克服了AAV单载体容量不足的问题，同时优化了其基因表达控制机制。通过采用神经元特异性启动子（hSYN promoter），研究团队成功将编辑器的表达限制在神经细胞中，从而避免了在非靶组织中的脱靶风险。此外，结合miR-183和miR-122 microRNA靶点，这一策略进一步减少了在肝脏等非靶组织的编辑表达，确保了治疗的安全性。
最重要的是，团队在优化编辑器和载体的同时，显著降低了所需的病毒剂量。在优化后的方案中，病毒剂量减少至原来的1/6.7，但仍能达到63%的PrP表达抑制水平，同时未观察到临床意义上的脱靶效应。这种低剂量、高效率的改良设计，不仅大幅减少了治疗相关的毒性风险，还提升了其临床转化的潜力。
尽管取得了巨大进展，挑战依然存在。脱靶效应、长期安全性和免疫反应仍需深入研究。这些优化措施的成功不仅为朊病毒疾病治疗提供了一个可行的解决方案，也为未来基因编辑技术的广泛应用树立了标杆。
未来：从小鼠到人类的可能性
这项研究在治疗朊病毒疾病方面的突破，不仅为这一类致命性疾病带来了希望，也为基因编辑技术的临床转化描绘了更广阔的前景。作为一种精准且高效的治疗工具，碱基编辑技术的潜力远远不止于此。它的成功应用可以扩展到其他基因驱动的神经退行性疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病以及亨廷顿病。这些疾病的病理特点往往涉及特定基因突变导致的毒性蛋白积累，而碱基编辑的精准性正好契合这一需求，为开发一次性治疗方法提供了可能性。
然而，从动物实验迈向人类临床应用仍面临诸多挑战。首先，跨越从小鼠到人的物种屏障是关键。尽管小鼠实验已证明碱基编辑器可以通过双腺相关病毒（Dual-AAV）系统高效递送至大脑，但在人中，血脑屏障的复杂性和病毒载体的免疫原性可能显著提高递送难度。此外，人类大脑体积远大于小鼠，这对病毒载体的分布范围和编辑效率提出了更高的要求。
其次，长期安全性和脱靶效应需要进一步评估。尽管本研究未观察到临床意义上的脱靶突变，但在人类基因组的复杂背景下，潜在的非特异性编辑仍需谨慎对待。此外，病毒载体的长期表达可能引发免疫反应，这在小鼠模型中无法完全模拟。
为应对这些挑战，未来的研究方向包括开发更高效、低免疫原性的病毒载体，如跨血脑屏障能力更强的AAV血清型。其次，加强体外和体内脱靶效应的全面评估，优化碱基编辑器以进一步提高其特异性。此外，临床前研究需要扩大到非人灵长类动物模型，以更接近人类的生理环境测试安全性和有效性。
这项技术的成功不仅对朊病毒疾病患者意义深远，更让我们看到了基因编辑技术在精准医学中的巨大潜力。从小鼠到人的这一步或许困难重重，但它所开启的，是一个有望改变罕见病治疗格局的新时代。每一步的前进都在让“不可治愈”变成“可能治愈”，为无数患者和家庭带来新的希望。